Edición de genoma libre de ADN de Brassica oleracea y B. rapa Protoplasts usando complejos de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9



El sistema de edición del genoma CRISPR/Cas9 ya ha demostrado su eficiencia, versatilidad y simplicidad en numerosas aplicaciones en células humanas, animales, microbios y plantas. Junto con la gran cantidad de bases de datos de genomas y transcriptomas disponibles, representa un enorme potencial para el fitomejoramiento y la investigación. Aunque la mayoría de los cambios producidos con CRISPR/Cas9 no difieren de las mutaciones que ocurren naturalmente, el uso de la transgénesis durante el desarrollo varietal todavía puede activar la legislación de OGM en países que dependen de la regulación basada en procesos.

Además, la integración estable de la codificación de ADN para las herramientas de edición del genoma en los genomas de las plantas puede resultar en mutagénesis de inserción, mientras que su expresión prolongada puede causar mutaciones en sitios fuera del objetivo sgRNA transcrito o sintetizado in vitro

Por lo tanto, el objetivo fue desarrollar un protocolo libre de ADN para la mutagénesis dirigida a tres especies del género Brassica (B. oleracea, B. napus y B. rapa) con el uso de RNPs. Elegimos el repollo, la colza y el repollo chino como representantes de las especies e introducimos RNPs en sus protoplastos con PEG 4000. Cuatro sgRNAs dirigidos a dos genes endógenos (el FRI y el gen PDS, dos sgRNAs por gen) fueron introducidos en las tres especies. 

No se detectaron mutaciones después de la transfección de protoplastos de colza, mientras que obtuvimos frecuencias de mutación de 0,09 a 2,25 % y de 1,15 a 24,51 % en repollo y repollo chino, respectivamente. En ambas especies, se mostró una correlación positiva entre la cantidad (7,5, 15, 30 y 60 μg) de enzima Cas9 y sgRNA introducidos y la frecuencia de mutación. Los cambios de nucleótidos (inserciones y deleciones) se detectaron 24 h después de la transfección y no difirieron 72 h después de la transfección. Eran dependientes de la especie, gen y locus. 

En resumen, demostramos la idoneidad de la transfección de RNP en protoplastos de B. oleracea y B. rapa para la inducción indele de alta eficiencia de dos genes endógenos. Debido a las relativamente altas frecuencias de mutación detectadas (hasta 24,51 %), este estudio allana el camino para la regeneración de plantas de Brassica mutadas con precisión sin el uso de transgénesis.


Publicación en inglés.



Tamaño: 3,19

Publicado: 15 de noviembre de 2018

Fuente: Frontiers Plant Sciences

Descargar documento